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                《廈門理工學院學報》  2020年第5期 47-52   出版日期:2020-10-30   ISSN:1673-4432   CN:35-1289/Z
                便攜式癌細胞熒光顯微成像系統的設計與實現


                隨著熒光成像技術的發展,熒光顯微技術已經成為一種新型生物光學顯微技術,可以用來研究細胞內部物質的運動狀態和化學物質的分布及定位等[1],因此熒光顯微成像技術被廣泛應用于醫學檢測領域,可以快速、準確地檢測出人體病變細胞[2]。隨著微流控和光電子技術的發展,國外市場化的激光誘導熒光分析儀器陸續推出[3],激光誘導熒光設備指標先進、性能穩定可靠,但都是通用型設備,設備體積比較大,價格昂貴,未見針對癌細胞檢測的便攜式設備。國內相關研究偏向于現有的激光誘導熒光檢測設備如何更精確地、定性定量地檢測出被測物,但是市場化的激光誘導熒光系統很少,更沒有癌細胞細分領域的專業熒光檢測設備[4]。 本研究采用新型超低噪聲科學級面陣CMOS探測器,配合散斑抑制和高效率的二向色鏡、LED光源模塊和電路板,采用半數字式對焦技術、萬兆網傳輸高分辨率圖像,設計出針對人體癌細胞的便攜式熒光顯微成像系統。 1系統的設計 在深入研究系統集成、便攜、光學設計、電子學、光譜分析等方面的基礎上,通過熒光成像的機理研究,選擇高效率的光學系統,配合微型高精度的半數字式對焦技術和高靈敏圖像采集技術,實現高性能的熒光成像系統。設計出結構緊湊、高性能的便攜式癌細胞熒光檢測系統。系統主要由光學部分和電子學部分組成,熒光成像系統框架如圖1所示。 圖1熒光成像系統結構框圖 Fig1Fluorescence imaging system block diagram 由圖1可見,光學系統由光源模塊(LED光源、散斑抑制器、擴束器)、二向色鏡片、濾光片和成像鏡頭構成;電子學系統由成像相機和電路板組成。電路板包含采集控制電路、電機控制模塊和萬兆網通信。系統工作流程是:首先電路板發出指令到光源模塊,LED光源發射激發光,經過均勻化和擴束后,通過二向色鏡片反射在被測物體上。被測物體的分子吸收激發光光子而發生能級躍遷產生熒光發射[5]。FPGA電路板根據評價函數結果驅動陶瓷電機運動,帶動物鏡移動,實現對被測物納米級別的自動聚焦,然后經過聚焦的光線通過二向色鏡片投射到濾光輪,經過成像鏡頭在探測器上熒光成像并存儲在電路板存儲器中,最后通過萬兆網將高清晰熒光圖像傳輸到電腦端。 廈門理工學院學報2020年 第5期黃新棟,等:便攜式癌細胞熒光顯微成像系統的設計與實現 11光學部分設計 光學部分主要由光源模塊、濾光片、透鏡、物鏡和成像鏡頭構成。由熒光的發光原理可知,待測物內部組織結構影響激發光照射到待測物產生的熒光波長,待測物內部成分含量決定熒光強度大小,因此不同細胞在吸收激發光時,在不同波段會激發出其熒光峰值,根據采集到的不同波段的熒光量值來判別不同細胞的存在。另外,激發光源的波長一般比熒光波長短。分子熒光光譜與激發光源的強度有直接關系,激發光源功率越大,熒光光譜越強[6]。因此選擇激光光源的時候主要考慮光功率、光源是否適合便攜式以及照明光源照射在被測物時拉曼散射光譜峰離開熒光光譜峰,便于光學系統將拉曼散射光譜濾除。系統采用二向色鏡和窄帶濾光片兩類濾光片,在濾光片前端采用半數字式對焦技術聚焦癌細胞,提高設備性能。同時要實現微米級細胞的清晰成像,需要實現納米級別的聚焦技術。 111光源 系統選用大功率LED燈作為光源,其具有壽命長、光毒性小、易于控制等諸多優點,并且系統主要用于觀測癌細胞,癌細胞的熒光光譜與正常細胞具有明顯特征區別,為了很好的觀測癌細胞,選擇綠色光、藍色光、紫色光波段的LED光源。LED光源輸出的光經過校正后存在散斑問題,這將直接影響最終的成像質量,所以采用散斑抑制器[7]將輸出激光均勻化,同時利用擴束器將光斑擴束,擴束角度約7°。光源散斑抑制器和擴束器一體化示意圖見圖2。 圖2光源散斑抑制及擴束一體化示意圖 Fig2Light source speckle suppression and beam expansion 112濾光片 選用二向色鏡和窄帶濾光片兩類濾光片。激發光照射到待測物,待測物產生發射光,窄帶濾光片用來過濾除熒光之外的其他光信號[8]。二向色鏡是激發光誘導熒光檢測裝置中的重要部件,對于不同波長光的選擇性極強,對一定波長的光完全透過,而對其余波長的光完全反射,利用這一特點來分離熒光與激發光[9]。二向色鏡的反射波長與激發光波長匹配,透射波長與癌細胞熒光發射波長匹配,對激發光光源的反射率和對熒光發射波長的透過率都達到95%以上。由于二向色鏡的濾波作用不可能達到100%,產生的熒光信號中或多或少摻雜了一些背景干擾光(主要是來自光學器件反射或者散射的激發光),所以在收集熒光之前需要利用窄帶濾光片進一步濾波。所用窄帶濾光片,要與熒光特征峰的波長相匹配。系統中的窄帶濾光片采用綠光、藍光、紫光波段,半寬為10 nm,峰值透射率大于97%,將其置于探測器前端,可進一步提高信噪比。 12電子學部分設計 電子學系統包括了探測器模塊、萬兆網通信、電機控制模塊和調焦電機。電子學的主要功能是采集傳感器圖像進行處理、顯示和傳輸,采集到的圖像進行清晰度計算并控制電機實現自動對焦,實現清晰圖像的采集并緩存到板載內存中,然后通過萬兆網將圖像數據發送到電腦。同時顯微鏡留有數字視頻(digital visual interface, DVI)顯示接口,可直接連接顯示器進行顯示。電子學的硬件電路框架如圖3所示。 圖3電子學電路結構框圖 Fig3Hardware circuit block diagram 核心的現場可編程門陣列(field programmable gate array, FPGA)芯片采用XILINX公司的Kintex7系列的XC7K420T芯片,具有高I/O帶寬與高數字信號處理能力,能夠高效進行圖像處理,性能高,成本低,功耗低。DVI顯示器采用DVI接口傳輸數字信號和數字圖像,傳輸速度快,色彩更逼真。先入先出(first input first output, FIFO)數據緩沖器沒有外部讀寫地址線,使用起來非常簡單。 121探測器模塊 熒光檢測器中的光電轉換元件要求有很高的靈敏度、很低的暗電流、很高的信噪比及較短的響應時間。目前大部分的熒光檢測設備都采用了具有超快響應速度和極高靈敏度的光電倍增管。而在激發光誘導熒光成像病變細胞檢測中,能夠實現高質量的面陣圖像,可提高系統性能,醫生可根據所獲取的熒光圖像更方便更高效地進行檢查和診斷[10]。選用新型超低噪聲和高靈敏度面陣探測器MT9P006 CMOS探測器,有效分辨率為2 592 px×1 944 px,像元尺寸是22 μm×22 μm,12 bit分辨率,靈敏度176 V·(lx·s)-1,適合做熒光顯微鏡圖像采集。 MT9P006傳感器接口如圖3所示,采用標準的視頻采集接口,方便FPGA采集。FPGA將從MT9P006傳感器采集到的圖像數據經過FIFO后緩存到DDR2內存芯片中。 122萬兆網通信 MT9P006傳感器可以實現2 592 px×1 944 px分辨率下的16 Hz,也可以實現1 280×720分辨率下的60 Hz采集,最高數據率達到923 Mbit·s-1,在不壓縮情況下,傳統的USB20接口不能實現高幀率的傳輸,只能通過降低幀率實現傳輸。萬兆以太網有10 Gbit·s-1網絡帶寬,具有傳輸延時低,傳輸距離遠的特點,適合實時視頻應用和圖像的實時傳遞,實現探測器高分辨圖像的高速傳輸。系統采用萬兆以太網接口連接電腦端,將顯微鏡下觀察到的圖像傳輸到顯示器,實現非壓縮圖像的快速、實時傳輸,并且可以通過客戶端軟件進行數據采集和參數設置。 系統的萬兆網協議采用Xilinx公司的CoreGenerator中自帶的Ten Gigabit Ethernet MAC IP核,IP核可極大地縮短開發周期和保證系統的穩定性[11]。IP核控制器用戶端采用XGMII接口,15625 MHz差分時鐘信號,在32 bit數據位寬下,理論數據率達到48 Gbit·s-1。與電腦的傳輸采用UDP方式,除去各種協議開銷,實測圖像傳輸速率達到18 Gbit·s-1,能夠實現顯微鏡圖像的實時傳輸。 123電機控制模塊 采用半數字式對焦技術,代替傳統顯微鏡手動對焦方法,實現物鏡的自動對焦。自動對焦通常分為兩大類:一類是測量鏡頭和被攝目標之間的距離;另一類是在焦平面上獲得清晰成像的焦點。第一類自動調焦依賴于測量距離的方法,復雜度高、成本大且難以實現,通常第二類對焦技術廣泛應用于顯微鏡的自動對焦[12]。采集到的圖像由FPGA實現圖像清晰度實時評價,通過評價函數實時調整電機,實現閉環控制,快速調焦。根據評價函數結果由FPGA驅動電機運動,帶動物鏡移動,從而獲得對焦清晰的圖像。在顯微操作系統中,自動對焦對于后期的細胞識別以及操作精度,起著重要作用。 系統采用改進的自動聚焦算法。探測器采集病變細胞圖像,在對焦開始時,先是粗調焦,采用較大的步長,讓目標更快在焦平面的附近成像;在靠近焦平面時,采用細調焦,使得所成的圖像更加清晰;實現攝像頭的自動調焦[13]。調焦階段采用Laplacian評價函數評價圖像清晰度,獲得評價函數最大值時,得到最佳清晰度圖像。探測器從粗調焦階段進入到細調焦階段判斷依據是探測器間隔移動相同的步長,獲取多組粗調焦圖片,計算其對焦評價函數的值,分析每組圖像評價函數值的變化率,當變化率出現極大值時,探測器由粗調焦進入細調焦。 124圖像清晰度評價函數 圖像清晰度評價是顯微鏡自動對焦過程中的一個重要步驟,物鏡從初始位置開始移動,利用評價函數計算清晰度,通過比較不同位置上圖像清晰度值的大小,物鏡向著能夠增加清晰度的方向移動,最終移動到清晰度不再增加的位置上,這個位置就是具有最大清晰度的焦點。通過圖像清晰度評價函數計算出在不同聚焦狀態下圖像的清晰度值,用來判斷圖像質量的好壞,圖像的清晰度不高,則相應的圖像就會比較模糊[14]。因此要選用實時性高,實用性強的基于圖像梯度的清晰度評價函數。 2實驗結果與分析 基于該系統設計,研制出針對人體癌細胞的便攜式熒光成像設備,樣機質量小于4 kg,功耗小于20 W。選用綠光作為照明光源,觀察癌細胞獲得熒光圖像。在觀察癌細胞過程中,探測器不斷采集癌細胞熒光圖像,根據圖像清晰度評價函數計算熒光圖像的清晰度值,移動鏡頭靠近焦平面,直到找到清晰度最高的圖像。選擇其中清晰度值變化比較明顯的4張熒光圖像作為一組,根據Tenengrad函數、Laplacian函數和方差函數3種圖像清晰度評價函數分別計算熒光圖像清晰度,熒光圖像清晰度值如表1所示。 表13種評價函數下的圖像清晰度值 Table 1Image sharpness value under 3 evaluation functions 評價函數圖片1圖片2圖片3圖片4Tenengrad函數1162 661802 382109 362192 40Laplacian函數1421 602081 262433 052525 99方差函數19086 4042092 4056976 4054088 90由表1可見,3種圖像清晰度評價函數分別計算出4張熒光圖片清晰度值的大小。從直觀判斷4張熒光圖片清晰度不斷增加,Tenengrad函數和Laplacian函數與直觀判斷一致,方差函數在判斷圖片3和圖片4清晰度時出現失誤,方差函數計算量小,但函數單調性較差。相比于Tenengrad函數,Laplacian函數精準性較好,在焦點附近變化較為明顯,靈敏度較高。因此,本系統采用Laplacian函數作為圖像清晰度評價算法。 系統采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)標本來觀察癌細胞,FISH技術是一種非放射性原位雜交技術,廣泛應用于生物學研究中,提高了基因定位的準確性。通過熒光顯微鏡觀察雜交信號,FISH在熒光顯微鏡下確認出癌細胞所在的位置,并且對癌細胞做出定性、定位或相對定量的分析。熒光檢測系統采用光譜濾光法,并且選用綠光、藍光、紫光3個激發光源切換觀察。 選擇表1中的4張熒光圖像作為一組,分別用綠光、藍光、紫光作為照明光源,切換觀察癌細胞獲得清晰的熒光圖像,對4張熒光圖像計算Laplacian函數評價,圖像清晰度評價函數值如表2所示。對應得到清晰度最高的熒光圖像如圖4所示。 表2Laplacian圖像清晰度評價函數值 Table 2Laplacian image sharpness evaluation function value 光源圖片1圖片2圖片3圖片4綠光1421 601781 262433 052525 99藍光0675 140802 151302 131447 33紫光0259 560301 420560 250696 25圖4不同譜段癌細胞熒光圖 Fig4Different spectrum of fluorescence emission from cancer cells 圖4(a)~圖(c)分別是在綠光、藍光、紫光激發下看到的細胞熒光圖像,圖像清晰度值對應表2中的圖片4。通過熒光發射不同頻段下癌細胞的細節信息,能夠看到目標熒光細胞的大小和位置區域,而且圖像邊界和細節部分清晰,分辨率達到10 nm。采用多波段LED光源,得到細胞多種波長熒光圖像,相互對比觀察,提高癌細胞識別的準確率。實驗結果能滿足對人體癌細胞檢測的靈敏度和圖像清晰度的要求。 3結論 選擇LED光源,采用科學級超低噪聲、超低暗電流、高靈敏的探測器,配合窄帶濾光片、二向色鏡,自動調焦時用Laplacian圖像清晰度評價函數,采用萬兆以太網傳輸圖像,設計出熒光顯微成像系統,并基于該系統,研制出針對人體癌細胞的便攜式熒光成像設備,樣機質量為4 kg,功耗小于20 W。實驗表明,樣機能夠實現清晰的多譜段癌細胞熒光成像和快速檢測,在降低噪聲干擾、提高靈敏度、自動對焦、高速通信方式等方面都有較大改進。
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